štěpená-Kaspáza-3 protilátka je markerem aktivity Dronc podobné Kaspáze-9 v Drosophile

značení štěpenou-Kaspázou-3 protilátka přetrvává v dvojitých mutantech dcp-1 drICE

abychom vyhodnotili specificitu štěpené-kaspázy-3 protilátky, analyzovali jsme oční imaginární disky z larev třetího instaru. U divokých očních imaginárních disků detekuje protilátka několik umírajících buněk rozptýlených po celém disku (obrázek 1a). Překvapivě, v očních discích dvakrát mutuje pro nulové alely dcp-1Prev a drICEΔ1 (ref .14, 15), štěpená-Kaspáza-3 protilátka stále označuje buňky (obrázek 1b). Značení v dcp-1Prev drICEΔ1 dvojitých mutantech se vyskytuje v klastrech (obrázek 1b), podobně jako to, co bylo pozorováno dříve, když byla buněčná smrt blokována expresí inhibitoru kaspázy – 3 P35. 3 tato pozorování by naznačovala, že štěpená protilátka kaspázy-3 stále detekuje epitop v nepřítomnosti proteinů podobných KASPÁZE-3 DCP-1 a DRICE. Nicméně, protože apoptóza v této fázi se nevyskytuje v definovaném vzoru, nebyli jsme si jisti specifičností těchto značkovacích signálů.

proto jsme použili GMR-hid transgeny, dobře charakterizovaný apoptotický model, 5 k dalšímu zkoumání specificity štěpené-kaspázy – 3 protilátky. Prostřednictvím GMR-řízené exprese pro-apoptotického genu hid specificky v zadní polovině vyvíjejícího se oka, GMR-HID transgeny indukují apoptózu ve dvou odlišných vlnách, jak je znázorněno štěpenou-Kaspázou – 3 protilátkou a tunelovým značením28 (obrázek 1c, d). Abychom vyhodnotili specificitu štěpené-kaspázy-3 protilátky, zkoumali jsme oční disky GMR-hid, které byly dvojnásobně mutované pro dcp-1Prev a drICEΔ1. V souladu s očekáváním ztráta dcp-1Prev a drICEΔ1 zcela ruší TUNELOVĚ pozitivní apoptózu U disků GMR-hid (obrázek 1f). Překvapivě však oční disky dcp-1Prev drICEΔ1 s dvojitou mutací GMR-hid stále vykazovaly silnou imunoreaktivitu s protilátkou štěpené kaspázy-3 (obrázek 1e). Štěpená-Kaspáza-3 protilátka tedy nedetekuje DRICE a/nebo DCP-1. Všimneme si však, že vzhled značení štěpené-kaspázy – 3 protilátky se mění v nepřítomnosti DCP-1 a DRICE (porovnejte obrázek 1c a e). Značkovací signál již není omezen na dvě odlišné vlny (obrázek 1c), ale spíše vyplňuje celý zadní prostor očního disku a je omezen na interommatidiální buňky (obrázek 1e). Podobná změna vzoru značení byla hlášena u značení protilátek CM1 po expresi inhibitoru kaspázy P35.3 Tato změna vzoru značení je pravděpodobně způsobena skutečností, že buňky v dcp-1Prev drICEΔ1 dvojité mutantní GMR-hid oční disky neumírají (obrázek 1f) a tak udržují epitop detekovaný štěpenou-Kaspázou – 3 protilátkou. Je však důležité poznamenat,že tato analýza demonstruje detekci epitopu v nepřítomnosti proteinů kaspázy-3 podobných DCP-1 a DRICE štěpenou protilátkou kaspázy-3.

imunoreaktivita štěpené-kaspázy – 3 protilátky závisí na složkách APOPTOSOMU DRONC a ARK

existují dvě možnosti, proč štěpená-Kaspáza-3 protilátka označuje dvojité mutantní buňky dcp-1 drICE, i když nejsou apoptotické. Za prvé, protilátka nemusí detekovat apoptotický epitop; nebo za druhé, protilátka může detekovat apoptotický epitop generovaný proti proudu nebo paralelně s DCP-1 a DRICE. Rozlišovat mezi těmito možnostmi, zkoumali jsme GMR-hid oční disky mutované pro apoptosomové komponenty DRONC a ARK, které působí proti proudu DRICE a DCP-1. U očních disků GMR-hid s mutací DRONC a ark jsou blokovány jak tunelové, tak štěpené-kaspázy-3 protilátky (Obrázek 1 g,h; obrázek 3a, b). Tato data potvrzují, že štěpená-Kaspáza-3 protilátka skutečně detekuje apoptotický epitop v přípravku Drosophila. Dále, protože nedokáže detekovat apoptotický epitop v mutantech dronc a ark, ale ne v dvojitých mutantech dcp-1 drICE, je přesnější považovat štěpenou-Kaspázu-3 protilátku za marker pro aktivitu DRONC, spíše než efektorová kaspázová aktivita, v umírajících buňkách Drosophily.

tripeptid ETD je apoptotický epitop detekovaný štěpenou-Kaspázou-3 protilátkou

epitop detekovaný štěpenou-Kaspázou-3 protilátkou závisí na aktivitě DRONC. Je možné, že protilátka přímo rozpozná aktivovaný DRONC. Alternativně je také možné, že štěpená-Kaspáza-3 protilátka detekuje epitop generovaný štěpením neznámého substrátu aktivním DRONCEM, nezávisle na DRICE a DCP-1.

abychom rozlišili mezi těmito dvěma možnostmi, zarovnali jsme zbytky z katalytického cysteinu (Cys163) do místa štěpení v Asp175 lidské kaspázy-3 (peptid kaspázy-3) s odpovídajícími oblastmi kaspáz Drosophila (obrázek 2a; viz také ref. 3). Většina C-koncových zbytků peptidu kaspázy-3, ETD, je konzervována v DRICE a DCP-1 (obrázek 2a). Podobně jako Kaspáza-3 se jedná o místo štěpení pro aktivaci alespoň DRICE, 29 a případně DCP-1. Je zajímavé poznamenat, že N-terminál, dvě třetiny peptidu kaspázy-3, nese nejvyšší podobnost s DRONC; šest z devíti zbytků je zachováno (obrázek 2a). Tato část peptidu kaspázy-3 je méně dobře konzervovaná v DRICE, DCP-1 a zbývajících kaspázách Drosophila. Ačkoli štěpení mezi velkými a malými podjednotkami DRONC není pro jeho aktivitu nezbytné, 30, 31 a nemusí se vyskytovat in vivo, zvažovali jsme možnost, že protilátky namířené proti n-koncové části peptidu kaspázy-3 mohou přímo detekovat aktivní DRONC v umírajících buňkách.

pomocí blokujících peptidů jsme vyhodnotili, které epitopy peptidu kaspázy-3 jsou detekovány štěpenou protilátkou kaspázy-3 v umírajících buňkách Drosophily. Sekvence blokujících peptidů jsou znázorněny na obrázku 2b a podtrženy na obrázku 2a. Blokující peptid a (TETD) je odvozen od DRICE a DCP-1 a blokující peptid B (CRGDEYDLG) odpovídá oblasti nejvyšší podobnosti v DRONC (obrázek 2a, b). Peptid C je kontrolní peptid odpovídající reziduím bezprostředně sousedícím s peptidem B v DRONC (obrázek 2a, b). Peptid D je další kontrolní peptid, který je velmi podobný peptidu a a je odvozen z prodomainu DRONC v poloze 113. Pokud je prodomain DRONC štěpen v tomto místě, vystaví ESD na svém C-konci, který je velmi podobný C-konci peptidu kaspázy-3 (ETD, peptid A) a může být tedy detekován štěpenou protilátkou kaspázy-3.

blokující peptidy byly smíchány s protilátkou štěpené-kaspázy-3 60 minut před inkubací s očními imaginálními disky. Výsledky blokačních experimentů jsou shrnuty na obrázku 2b a pro peptidy A A B znázorněné na obrázku 2c-f. Peptid a je dostatečný k blokování celé imunoreaktivity štěpené-kaspázy-3 protilátky v GMR-hid a v dcp-1 drICE dvojité mutantní GMR-hid oční disky (obrázek 2c, d). Naproti tomu peptid B neruší imunoreaktivitu protilátky v těchto discích (obrázek 2e, f). Kontrolní peptidy C A D také nedokáží blokovat štěpenou-Kaspázu – 3 imunoreaktivitu (obrázek 2b; údaje nejsou zobrazeny).

tyto údaje ukazují, že štěpená-Kaspáza-3 protilátka specificky detekuje epitop ETD v apoptotických buňkách. Mezi kaspázami Drosophila je tento epitop přítomen pouze v DRICE a DCP-1, takže je velmi pravděpodobné, že protilátka skutečně detekuje tyto efektorové kaspázy. Naproti tomu skutečnost, že peptidy B, C A D odvozené od DRONC blokují imunoreaktivitu, naznačuje, že je nepravděpodobné, že by protilátka přímo detekovala aktivní DRONC. Proto, protože štěpená-Kaspáza-3 protilátka neztrácí imunoreaktivitu v dcp-1 drice dvojitých mutantech (obrázek 1e), detekuje alespoň jeden další protein, který vystavuje epitop ETD způsobem závislým na DRONC.

aktivace DCP-1 nezávisle na ARK obnovuje štěpenou-Kaspázu-3 imunoreaktivitu

analýza uvedená na obrázku 2 naznačuje, ale neprokazuje, že štěpená-Kaspáza-3 protilátka skutečně detekuje štěpenou DCP-1 a DRICE. Abychom tuto možnost přímo otestovali, vyjádřili jsme GMR-ΔN-dcp-1 transgen v pozadí ark mutant. ΔN-dcp-1 postrádá N-terminální prodomain DCP-1. Předpokládá se, že PRODOMAIN-depleted ΔN-DCP-1 snadno podporuje autoprocessing a konzistentní exprese pod kontrolou GMR indukuje fenotyp ablace oka.32 tento oční ablační fenotyp je způsoben indukcí apoptózy (obrázek 3c, d). Jak bylo uvedeno výše, Ark mutantní klony v pozadí GMR-hid nedokáží indukovat TUNEL-pozitivní apoptózu (obrázek 3b) a štěpená-Kaspáza – 3 protilátka nemá žádnou imunoreaktivitu v klonech ark (obrázek 3a), což naznačuje, že ani DCP-1, DRICE ani neznámé substráty DRONC nejsou štěpeny v klonech ark mutantů. Proto jsme testovali, zda exprese ΔN-Dcp-1 v nepřítomnosti aktivity APOPTOSOMU, to znamená v klonech ark, může obnovit značení protilátek štěpené-kaspázy-3. Ve srovnání s tkání divokého typu (označenou GFP na obrázku 3c, c‘) je počet štěpených-Kaspázových-3 pozitivních buněk silně snížen v klonech mutovaných ark (obrázek 3c, c‘), což naznačuje, že aktivace ΔN-DCP-1 je alespoň částečně závislá na apoptosomu. Avšak asi 50% Ark mutantních klonů (n=32) v pozadí GMR-ΔN-Dcp-1 obsahuje štěpené-kaspázy-3 imunoreaktivní buňky (šipky na obrázku 3c, c‘). Je nepravděpodobné,že by to byl značkovací artefakt, protože tyto buňky jsou také TUNELOVĚ pozitivní (obrázek 3d, d‘). Proto, protože DRONC je neaktivní v pozadí Ark mutantů, což naznačuje, že signál značení štěpené-kaspázy-3 není způsoben neznámým substrátem DRONC, tato analýza ukazuje, že štěpená-Kaspáza-3 protilátka skutečně detekuje štěpený DCP-1. Je také možné, že štěpená-Kaspáza-3 protilátka detekuje štěpenou DRICE v tomto experimentu, protože DCP-1 může proteolyticky zpracovat DRICE, alespoň in vitro.29, 32 podobná analýza s DRICE nemohla být provedena, protože GMR-drICE a GMR-ΔN-drICE nezpůsobují fenotyp ablace očí.32 nicméně, zda DCP-1 štěpí DRICE in vivo nebo ne, vzhledem k sekvenční podobnosti DCP-1 a DRICE na C-konci velké podjednotky A údajům o blokování peptidů z obrázku 2 naznačuje, že protilátka může také detekovat štěpenou DRICE.