Úloha signálů chordin / Bmp v savčím vývoji hltanu a DiGeorge syndromu | vývoji

výsledky

defekty gastrulace u chrd-/- myší

protein vázající Chrd vylučovaný Bmp je exprimován v myším uzlu ajeho deriváty, notochord a faryngeální endoderm (obr. 1A-F). Protein Chrdobsahuje čtyři domény bohaté na cystein (CR), Z nichž všechny jsou schopny vázat Bmps.CR1 a CR3 vykazují nejvyšší afinitu k Bmp4 a mohou antagonizovat signály Bmp po injekci mRNA do embryí Xenopus(Larrain et al., 2000). Abychom získali nulovou alelu Chrd, připravili jsme zaměřovací konstrukt s translačními stop kodony ve třech možných čtecích rámcích v oblasti signálního peptidu. Stop kodony byly následovány snímkovým posunem a po CR1 vložením kazet IRES-lacZ a PGK-neo, které dále narušily Gen Chrd (obr.1G). Transkripty z této alely Chrdtm1DR (dále jen Chrd-) byly Nedetekovatelné inchrd – / – embrya ve fázi uzlu (obr. 1J, šíp).

heterozygotní chrd myši byly životaschopné a fertilní a byly spářeny s generovanými chrd – / – embryi různých vývojových stages.At den E8. 5 jsme pozorovali přítomnost resorpčních uzlů v děloze těhotných žen a malé snížení očekávaného počtuchrd – / – embryí (50 obnovených, 57 očekávaných). Fourgenotyped homozygotní mutantní embrya vykazovala jasné snížení velikostimbryonální oblasti, doprovázené zvětšením alantois srespekt ke zbytku embrya (obr.2A,A“). V histologických řezech je značná hypoplazieneurální desky(obr.2B, B‘), absence somitů a notochordu (obr. 2C, C‘) a anabundance extraembryonálních mezodermálních buněk v alantois(obr. 2D, D‘) byly pozorovány. Zbytek mutantů (46) byl morfologicky nerozeznatelnýod jejich heterozygotních a divokých vrhů. Fenotyp fourabnormálních mutantů byl podobný, ale méně výrazný než ventralizace mezodermu pozorovaná u dvojitých homozygotních Chrd; Nogmutanty (Bachiller et al ., 2000), ve kterém byly navíc přítomny také přední zkrácení neuralplate.

u zebrafish a Xenopus způsobuje inaktivace Chrd anexpanzi ventrálního mezodermu a redukci dorzálního mezodermu a neuralplate (Schulte-Merker et al .,1997). U savců se mezoderm tvoří během gastrulaceingrese epiblastových buněk primitivním pruhem. Buňky vystupující na zadním konci primitivního pruhu se pohybují do extraembryonální oblasti, kde vedou k mezodermální linii (alantois, amnion a bloodislands žloutkového vaku) ekvivalentní ventrálnímu mezodermu Xenopus. Naproti tomu buňky umístěné ve více předních oblastech těla zůstávají uvnitř vlastního embrya a produkují paraxiální, meziproduktua laterální desková mezoderm budoucího kmene. Časný fenotyp chrd – / – mutantů, ve kterém je alantois rozšířen na úkor embryonálního mezodermu, je v souladu s časnou ventralizací myšího embrya. Tento fenotyp musí vést ke smrti postiženýchzvířata, protože v pozdějších stádiích nebyl získán Žádný homozygotní mutant s abnormálními alantoisami. Analýza tohoto fenotypu s molekulárními značkynebylo provedeno, protože bylo získáno tak málo abnormálních embryí.

perinatální letalita

pouze 49% (95 ze 194) očekávaných Chrd-/-zvířat bylo nalezeno při narození, všechna vykazovala stejný plně penetrantfenotyp. Z nich, většina byla mrtvě narozená,ale několik se pokusilo, neúspěšně, nafouknout plíce. Externě, homozygotní mutantní novorozencibyly o něco menší než jejich vrhy divokého typu a vykazovaly cyanózu, mikrocefalii a redukci vnějšího ucha, která byla nastavena abnormálně blízkooko (obr. 3A“).Histologické vyšetření (obr.3B‘-C‘) odhalil nedostatek brzlíku (t, derivát třetího hltanového vaku) a sekundárního patra (p) a hypoplazie vnitřního ucha (ie) u mutantů. Přední lalok a pars intermedia hypofýzy (pi), oba odvozené z dorzální ústní ektodermy okamžitěsousedí s cefalickou hranicí předního endodermu, byly normální (obr. 3C,C‘). Totodefinoval rostrální limit fenotypu v orofaryngu, smalformace omezené na deriváty chrd-expressingendodermu. Štítná žláza, která se tvoří ve ventrálním faryngálním endodermu na foramen caecum, se diferencovala, ale byla hypoplastická a nepravidelného tvaru (th, obr. 3C“). Aparatyreózní žlázy, deriváty faryngálních sáčků 3 a 4, chyběly (údaje nejsou zobrazeny), pozorování v souladu s novorozeneckou hypokalcemií u jedinců s DiGeorge syndromem(DiGeorge, 1968). Dospěli jsme k závěru, že fenotyp chrd – / – mrtvě narozených myší rekapituluje většinu rysů popsaných u těchto jedinců.

kosterní defekty

v kosterních přípravcích Chrd – / – novorozených zvířat byly apendikulární a bederní kosti normální, ale základna lebky apřední axiální kostra vykazovala více defektů. Změny v temporální kosti zahrnovaly nedostatek squama temporalis (st) a zkrácení zygomatického oblouku (obr.4A, A“). Také jsme pozorovali značnou hypoplaziihyoidní kosti a štítné žlázy a cricoid laryngeální chrupavky (obr. 4B‘) a anabnormálně malá čelist (obr.4C“). Ve spodní části lebky se alisfenoid (as)zdál normální, ale ve střední linii byly bazioccipitální(bo) a basisfenoidní (bs) kosti fúzovány a presfenoid(ps) byl hypoplastický (obr. 4D, D‘). Konzistentnís histologickými nálezy se palatinové police nepodařilo mediálně rozšířit, aby vytvořily sekundární patro. V uchu je tympanický kroužek a Otická kapsulabyly redukovány a deformovány (obr.4D‘). Kosterní malformace byly také pozorovány v krčkua hrudní oblasti páteře. Těla obratlů (vb) bylamenší u chrd – / – novorozenců (obr. 4E‘), se zpožděnímosifikace a příležitostná ztráta dalších prvků obratlů, jako jepinózní procesy, nervové oblouky a přední oblouk atlasu (obr. 4E a Fig. 5A“).

kosterní defekty mutantů Chrd byly již detekovatelné vkartilage kondenzace na E14. 5 (obr.5A, A“). Baziokcipitální a bazifenoidní chrupavky bylyodfuzované a osifikační centrum basiokcipitalu bylo užší arozšířeno do bazifenoidu (obr.5B, B“). Přední notochord, který byl přítomen vmidline divokého typu basioccipital, chyběl u mutantů Chrd(obr. 5B, B“). Nepřítomnost předního notochordu byla potvrzena histologickým vyšetřenímcervikální oblast na E14. 5 (obr.5F“).

kosti postižené mutací Chrd mají velmi odlišnépůvod. Basioccipital je čistě somitického původu; části bazisfenoidu vznikají z endochondrální osifikace cefalického mezenchymu; thepalatin pochází z intramembranózní osifikace neurálního hřebenu-odvozenmesenchymu; Otické tobolky se liší od směsi paraxiálních mezodermandových neurálních hřebenových buněk; a hyoid je přísně odvozen od neurálního hřebenu (Le Douarin a Kalcheim, 1999). Uprostřed takové rozmanitosti linií se zdá, že sjednocujícím principem fenotypu je umístění malformovaných struktur v blízkosti axiálního mezendodermu exprimujícího Chrd(obr. 1E). Tato interpretaceje v souladu s pozorovanou předčasnou degenerací anteriornotochordu u Chrd – / – zvířat as požadavkemprechordální deska a signály odvozené z mezendodermu pro vývoj kostry hlavy (Belo et al ., 1998; Couly a kol., 2002; David a kol.,2002).

DiGeorge-like kardiovaskulární defekty

cyanóza pozorovaná při narození může být známkou srdeční poruchy. Abychom to dále prozkoumali, byly provedeny disekce v různých stádiích embryonálního vývoje. Na E14.5, srdce zvířat vykazovala v srdečním výtokovém traktu jednu cévu místo dvou (obr. 5D,D‘,E,E‘).Tento stav je u lidí znám jako perzistentní truncus arteriosus a je animační malformací u jedinců s DiGeorge syndromem. Nedostatekoddělení mezi vzestupnou aortou a plicním kmenem se může zvýšitpracovní zatížení pravé komory způsobující její hypertrofii, stejně jakovazodilatace, edém a krvácení pozorované u embryí E14, 5 (obr. 5C“). Jako syndrom inDiGeorge se defekty kardiovaskulárního systému rozšířily nadalektní trakt a zahrnoval velké cévy odvozené z faryngálních archarterií (obr. 6). U novorozencůrd mutantů se společné krční tepny přímo připojily k truncusarteriosus, což vedlo k absenci brachiocefalické tepny a částiaortální oblouk (obr. 6A-C).Plicní tepny pocházely přímo z proximálního truncusarteriosus, což vedlo k absenci společného plicního kmene (obr. 6A-C). Kromě toho byly pozorovány defekty laterality s abnormálním pravým otočením aorty 40% mutantů (obr. 6, porovnat 6s 6F). Když byly disekce provedeny ze zadní strany, to bylobylo vidět, že v závislosti na lateralitě sestupné aorty, pravé nebo levé subklavní tepny přijaly abnormální retroezofageální polohu (obr. 6D-F). Podobné účinky byly popsány u kuřecích embryí s ablacemi neurálních hřebenových buněk (Kirby et al., 1983), a inmice nesoucí delece v kongenické oblasti DiGeorge (Lindsay et al., 1999; Merscher a kol., 2001) ormutace v Tbx1 a Fgf8 (Abu-Issa et al., 2002; Frank a kol., 2002; Jerome a Papaioannou, 2001; Lindsay a kol., 2001; Vitelli et al., 2002b).

při narození bylo pouze 49% očekávaných chrd homozygotních mutantůobnoveno. Avšak 48 z očekávaných 56 (86%) embryí Chrd-/-bylo stále naživu ve vrzích pitvaných při E14. 5, což není četnost významně odlišná od frekvence pozorované u E8 .5 (88%). Prudký nárůst letality po E14. 5 se shoduje s plným projevemkardiovaskulárního fenotypu a naznačuje, že porucha oběhu je důležitou příčinou úmrtnosti Chrd – / – embryí běhempozdní těhotenství.

abnormality hltanu

k určení nástupu fenotypu hltanu jsme pitvali pregnantfemales z heterozygotních Páření v různých časech po koitum. Na E9.0, astage, při kterém je Chrd exprimován v hltanu endoderm, Chrd – / – embrya by mohla být identifikována odsazením v oblasti krku (obr.7A‘, šíp). Otické vezikuly mutantů byly sníženyna polovinu jejich normálního průměru (obr.7A‘, šípy) a druhý (hyoidní) faryngální oblouk bylmissing. Faryngální oblouky tři až šest se nikdy nevytvořily v mutantních embryích (obr. 7B ‚ a údaje nejsou uvedeny). Chybějící nebo malformované struktury jsou buď přímými prekurzory nebohrát induktivní role během vývoje mnoha orgánů, které jsoudefektivní při narození u Chrd – / – myší. Vzhledem k tomu, že většina fenotypových abnormalit pozorovaných u novorozených mutantů má svůj embryologický původ v endodermu hltanu a perifaryngeální oblasti, analyzovali jsme expresi řady genů, o nichž je známo, že mají důležitý vývojrolů v dědičném onemocnění člověka.

nejprve jsme zkoumali expresi Pax3, transkripčního faktoru exprimovaného v nervovém hřebenu, dorzální neurální trubici a somitech (Goulding et al., 1991). Inhumans, PAX3 je mutován u onemocnění neurálních hřebenů označenýchwaardenburgův syndrom typy 1 a 3 (Strachan a Read, 1994) aje spolu s SOX10 spolu s mikroftalmií genu orMITF (Bondurand et al ., 2000), transkripční faktor mutovaný u Waardenburgova syndromutyp 2a u lidí (Tassabehji et al.,1994). Mutace Pax3 v splotch (Sp2H) myší vede k srdečním vadám, včetněpersistentní truncus arteriosus, stejně jako malformace brzlíku, štítné žlázya příštítných tělísek (Conway et al .,1997). Zjistili jsme,že exprese Pax3 bylarozlišitelné mezi mutantními a divokými embryi na E7.5 (není zobrazeno), ale u E10.5 byly pozorovány významné rozdíly. Pax3-pozitivníneurální hřebenové buňky, které migrují přes faryngální oblouky 3, 4 a 6 (obr. 7C, šípy) byly zřídka detekovatelné u Chrd – / – zvířat (obr. 7C“). Tyto neuralkrestové buňky naplňují přepážku oddělující aortu od plicní arteriev výtokovém traktu nebo konotrunální oblasti srdce (Li et al., 2000). Selhání srdečního neurálního hřebenu k dosažení srdce vysvětluje nedostatek výtokových traktůseptace a následný kardiovaskulární fenotyp pozorovaný u mutantů chrd. Je zajímavé, že exprese Pax3 v jiných tkáníchjako mandibulární (md) složka prvního faryngálního oblouku, dermomyotomy (dm) a prekurzory myoblastů v předních končetinách (fl) nebyly ovlivněny(obr. 7C“).

dále jsme provedli in situ hybridizace se sox10, genemutovaným u jedinců s Waardenburgovým syndromem typu 4(Pingault et al., 1998), kterýje exprimován v nervových hřebenech a Schwannových buňkách. Při E7.5 byla exprese tox10 stejná u embryí Chrd – / – a v jejich divokých vrzích (údaje nejsou uvedeny). Při E9, 5 byla Sox10exprese v dorzálních kořenových gangliích(drg) kmene normální (obr. 7B, B‘), aledistribuce gliových buněk exprimujících Sox10 odhalila specifickévady v Organizaci periferního nervového systému v oblasti krku ahlava mutantů (obr.7B“). Zejména kraniální senzorické ganglie vykazovaly značenéabnormality. Trigeminální (tr) a vestibulo-kochleární (vc) ganglia,odpovídající hlavovým nervům V A VIII, byly lokalizoványblízčí společně v embryích Chrd-/- než v wild-typelittermates. Kromě toho byly pozorovány abnormální nervové projekce spojující obě z nich (obr. 7B‘, hrot šípu). Nejvíce postiženy byly genikulátové (g), petrosální (p) a nodózní (n) ganglie odpovídající hlavovým nervům VII,IX a X, které vykazovaly extrémní zmenšení velikosti nebo úplnou nepřítomnost. Tyto tři gangliepůvodní z epibranchiálních placodů a je známo, že vyžadují induktivní signály z předního endodermu pro jejich správný vývoj(Begbie et al., 1999). Nedostatek epibranchiálních ganglií odvozených od placody naznačuje, že vylučovaný proteinChrd je nutný pro aktivitu induktivního signálu uvolněného endodermem hltanu.

Pax9 je transkripční faktor potřebný pro vývoj endodermu hltanu a jeho derivátů u myší (Peters a Balling, 1999;Peters a kol., 1998). Na E9.5, exprese Pax9 v hltanovém endodermu embryí chrd – / – byla slabší než u jejich divokých typůlittermates (pe, obr.7D, D‘). Exprese Pax9 odhalila, že velikost atvar hltanu byl změněn u mutantů Chrd, přičemž faryngální hrboly byly sníženy na jediný otok v přední části (obr. 7E, E“). Ahypoplazie hltanu byla potvrzena histologickými úseky E14. 5embryos, ve kterých se přední endoderm objevil jako tenká trubice naznačující příjemně zmenšený lumen (ph, obr.5F,F‘). Snížení endodermu hltanu bylo taképozorováno u Xenopus Chrd knockdowns (Oelgeschläger et al.,2003). Nefaryngeální oblasti, ve kterých je PAX9 mRNA normálně exprimována, jako jsou somitické sklerotomy(sc) a mezenchym obličeje (fm), neprokázaly rozdíly v distribuci nebo hojnosti transkriptů (obr.7F, F‘).

z těchto studií vyvozujeme, že změny exprese Pax3, Sox10 a PX9 jsou omezeny na velmi omezenou oblast widerexpresních domén, což naznačuje, že nedostatek vylučovaného proteinu Chrdspecificky narušuje místní regulační dráhy působící v perifaryngeální oblasti obklopující endoderm exprimující Chrd.

exprese Tbx1 a Fgf8 vyžaduje chordin

ke studiu interakce Chrd s geny, o nichž je známo, že způsobují fenotypy podobné DiGeorge nebo DiGeorge u myší, analyzovali jsme expresibx1 a Fgf8 v embryích mutovaných Chrd. Tbx1je členem rodiny transkripčních faktorů T-box(Papaioannou a Silver, 1998). Mapuje v rámci mikrodelece DGS / VCFs 22q11 u lidía nedávno bylo prokázáno, že způsobuje fenotyp podobný DiGeorge při inaktivaci u myší (Jerome a Papaioannou,2001; Lindsay a kol., 2001; Merscher et al., 2001; Vitelli et al., 2002a). Exprese Tbx1 byla změněna v embryích chrd -/ -. U zvířat divokého typu E7. 5, Tbx1je vyjádřena v foregutu (budoucí faryngální endoderm) a mezodermu hlavy (obr. 8A). V této fázi vykazovaly mutantní vrhy jasné snížení hladin Tbx1exprese ve stejných oblastech (obr.8A“). Snížení mRNA Tbx1 bylo stejně jasnév oblasti hltanu homozygotních embryí Chrd při E8. 0, E8.5 ae9. 0 (obr.8B‘, C‘, D‘). Příčné histologické úsekyukázalo, že na buněčné úrovni je hojnost transkriptů Tbx1byl drasticky snížen v endodermu, a to jak v hltanu, tak v předklonu až doúroveň jaterního divertikula(obr.8f-H‘) snížení koncentrace Tbx1 mrnabylo také patrné v mezodermu, včetně hlavy, splanchnic (šipky) asomatický mezoderm (šipky) v perifaryngeální oblasti (obr.8F‘,G‘,H‘). Kromě toho byla Tbx1exprese na E9 v mezodermálním jádru prvního hltanového obloukudifuzní, rozšiřující se na většinu oblouku, a Tbx1 transkripty bylyabsent z otického váčku (obr.8D-D‘).

Fgf8 je vylučovaný růstový faktor vyjádřený v různétkáně, včetně faryngálního endodermu a sousedního mezodermu(Crossley a Martin, 1995; MacArthur et al., 1995).Během raného vývoje je pro gastrulaci nutný Fgf8 (Sun et al., 1999) a založení levé / pravé osy symetrie (Meyers a Martin, 1999). Atlater fáze Fgf8 je vyžadován pro končetiny (Lewandoski et al., 2000; měsíc a Capecchi, 2000) andcraniofacial (Trumpp et al., 1999) vývoj. Nedávné experimenty ukázaly, že myši ssnížená aktivita Fgf8 představuje spektrum kardiovaskulárních afaryngeálních defektů, které úzce napodobují Digeorgeův syndrom (Abu-Issa et al., 2002; Frank a kol., 2002). Kromě toho je exprese Fgf8 zrušena v endodermu hltanu mutantů BX1 – / – a oba geny geneticky interagují běhemdiferenciace tepen hltanu (Vitelli et al., 2002b). Ate9, exprese Fgf8 u mutantů Chrd je normálnístřední-zadní mozkový isthmus, frontonasální prominence a ocas. U faryngeálního endodermu jsou však hladiny přepisu Fgf8 drasticky sníženy (obr. 8E“). Redukce exprese Tbx1 a Fgf8 v embryích Chrd – / – naznačila, že oba geny působí po proudu Chrd stejnou regulační cestou. Tyto experimenty neurčují, zda Chrdje nutné pro údržbu nebo pro indukci Tbx1 afgf8 v hltanu a sousedních tkáních.

abychom otestovali, zda Chrd může indukovat Tbx1 a Fgf8, injikovali jsme Chrd mRNA (50 pg) do ventrální oblasti embryí Xenopus ve čtyřbuněčném stádiu. Explantáty ventrální marginální zóny (VMZ) byly disekovány v časné gastrule, kultivovány až do sourozeneckých embryí, které dosáhly časného stádia neuruly, a analyzovány RTPCR. MRNA Tbx1 afgf8 byly exprimovány na vysokých hladinách v celých embryích a explantátech dorsalmarginální zóny (DMZ)v této fázi a na nízkých hladinách v EXPLANTÁTECH VMZ(obr. 8I, dráhy 1-3). Uponmikroinjekce, Chrd mRNA zvýšila hladiny Tbx1 afgf8 ve VMZ (obr. 8I, lane 4). In situ hybridizace mikroinjekovaných embryí Xenopuspotvrdil, že transkripty Tbx1 indukované Chrd mrnabyly umístěny ve faryngálním endodermu(údaje nejsou zobrazeny). Došli jsme k závěru, thatChrd, antagonista Bmp, může indukovat expresi Tbx1 a Fgf8 v embryích Xenopus a je vyžadován pro plnou expresitutyto geny v oblasti hltanu myšího embrya.